如何构建稳定细胞株？ 一文读懂关键步骤与技术难点

细胞系开发（CLD）是生物制造过程中关键但耗时的步骤，通常需要投入大量资源来扩增和筛选数百至数千个单细胞克隆。通常，转染的细胞池在完全恢复后进行生长、生产力和产品质量的表征，以确定适合单细胞克隆（SCC）的最佳细胞池。在药物开发、癌症研究以及基因功能分析等生物医学研究领域中，细胞株筛选占据了重要地位。稳定细胞株常用于抗体、重组蛋白药物的生产，基因与细胞治疗药物的制备，疾病模型的建立，基因功能研究，信号传导和药物靶点研究等。那稳定细胞株是如何进行构建的呢？简单介绍一下构建的基本流程：

一、传统流程
1.细胞选择与准备：
细胞类型选择：根据研究目标选择合适的细胞系（如HEK293、HeLa、CHO等）或原代细胞。需确保细胞来源的可靠性和背景清晰度。
细胞培养条件优化：确保细胞处于最佳生长状态，培养基、血清、温度、CO₂浓度等参数需严格标准化。
细胞鉴定：通过STR（短串联重复序列）分析确认细胞身份，排除交叉污染。

2.基因编辑工具选择与设计
编辑工具：CRISPR/Cas9、TALEN或ZFN是常用基因编辑工具。CRISPR/Cas9因高效、便捷成为主流。
sgRNA设计：针对目标基因设计特异性sgRNA，使用在线工具（如CRISPR Design或Benchling）预测脱靶效应，确保靶向准确性。
供体模板设计：如需基因敲入，需设计同源重组供体模板（含同源臂和目的序列），长度通常为500-1000 bp。

3.转染与基因编辑
转染方法：根据细胞类型选择转染方式（脂质体转染、电穿孔、病毒转导等）。原代细胞或难转染细胞可选用慢病毒或腺病毒系统。
编辑效率验证：转染后48-72小时提取基因组DNA，通过T7E1酶切、测序或Surveyor assay检测编辑效率。

4.筛选与单克隆化
筛选标记：使用抗生素（如嘌呤霉素、G418）或荧光蛋白（如GFP、RFP）筛选成功编辑的细胞。
单克隆化：通过有限稀释法或流式细胞分选获得单克隆细胞。有限稀释法需将细胞稀释至0.5-1个细胞/孔，培养2-3周。
克隆扩增：挑选生长状态良好的单克隆，逐步扩大培养。

5.基因编辑验证
基因组水平：通过PCR和测序确认目标基因的敲入或敲除。
转录水平：qPCR检测目标基因mRNA表达变化。
蛋白水平：Western Blot或免疫荧光检测目标蛋白表达。

6.功能验证
表型分析：根据研究目标设计功能实验，如增殖、凋亡、迁移等。
稳定性检测：连续传代（至少10代）检测细胞株的遗传稳定性。

7.冻存与保种
冻存液配制：使用含10% DMSO和90% FBS的冻存液。
冻存程序：细胞以1×10⁶/mL密度冻存，程序降温（-1°C/min）至-80°C后转入液氮长期保存。
复苏检测：复苏后检测细胞存活率及目标基因表达，确保细胞株稳定性。

8.数据记录与标准化
实验记录：详细记录每一步操作参数（如细胞代数、转染条件、筛选浓度等）。
标准化流程：建立SOP（标准操作程序），确保实验可重复性。


二、传统细胞株构建的不足
1.时间与原料成本较高
整个细胞株构建过程流程复杂，需要消耗大量的时间，使用的试剂和设备比较昂贵。

2.随机性
外源基因整合进宿主染色体上的几率很小，通常发生随机整合，其表达水平和整合位置有关，会受周围染色体元件的影响，因此需要大量的筛选工作来获得能够稳定表达的细胞株。

3.低成功率
实验或操作细节上的错误都可能导致项目的失败，成功率较低，导致整体成本较高。


在细胞株构建的过程中，时间成本、随机性和成功率低等问题一直是研究人员面临的挑战。随着生物技术和仪器的发展，市面上出现了很多自动化解决方案，追光生物推出的OptoBot^® 1000 单细胞光电微流控系统，正是针对这些难点而设计。


三、OptoBot^®1000的优势
1.高效的单细胞克隆
OptoBot^®1000单细胞光电微流控系统采用微流控芯片技术，能够在封闭的芯片中隔离单细胞，并通过重复的生长和生产力筛选预先选择高活力和高生产力的细胞系。相比传统的有限稀释法或FACS，显著提高了单细胞克隆的效率。

2.加速时间线
OptoBot^®1000单细胞光电微流控系统在微流控芯片上可以对单细胞进行精准操控，通过系统自带的细胞株开发流程可以在5天内筛选出高产细胞株。

3.资源节约
OptoBot^®1000单细胞光电微流控系统能够在克隆扩增前进行生长和分泌筛选，减少需要导出的克隆数量，从而降低后续筛选和放大培养的资源消耗。

4.高成功率
OptoBot^®1000单细胞光电微流控系统通过精确的单细胞隔离和筛选，提高了克隆的成功率，减少了实验失败的风险。

5.自动化与标准化
OptoBot^®1000单细胞光电微流控系统提供自动化的操作流程和标准化的实验步骤，确保实验的可重复性和一致性。

OptoBot^®1000减少了克隆筛选和扩增的资源消耗，能够在细胞活力较低的情况下分离出符合制造需求的高性能克隆，促进细胞株开发应用后续新药研发或抗体药物发现。OptoBot^®1000单细胞光电微流控系统具有高效、稳定、可追溯的特点，能够帮助研究人员节省大量时间和人力成本，同时确保实验结果的可靠性。